MicroRNA’s als potentiële biomarkers in de NK-cellen van patiënten met ME/cvs

Diagram van het process van miRNA met mRNA (By Kelvinsong – Own work, CC BY 3.0, bit.ly/1Rx9LTW)

Auteurs

Petty RD, McCarthy NE, Le Dieu R, Kerr JR

Instituut

CFS Group, St George’s University of London, Cranmer Terrace; Centre for Haemato-Oncology, Bart’s cancer institute, Queen Mary University of London, London, UK; Grupo de Salud Publica, Escuela de Medicine y Ciencias de la Salud, Universidad del Rosario, Quinta de Mutis, Bogotá, Colombia.

Samenvatting

Achtergrond

Chronisch vermoeidheidssyndroom (ME/CVS) is een complexe multisysteemziekte van onbekende etiologie die invaliderende symptomen veroorzaakt bij 1% van de wereldbevolking (nvdr. dit is een te ruim geschat getal). Hoewel een groot gedeelte van genen heeft aangetoond veranderde expressie te vertonen bij ME/CVS-patiënten, is het tot op heden nog niet bekend of microRNA (miRNA)-moleculen die de genetische vertaling reguleren, bijdragen tot de pathogenese van de ziekte. Wij hypothetiseerden dat veranderingen in microRNA-expressie in de leukocyten van patiënten bijdragen tot de pathologie van ME/CVS, en daarom nuttige diagnostische biomarkers zouden kunnen vertegenwoordigen die kunnen worden opgespoord in het perifeer bloed van ME/CVS-patiënten.

Methoden

miRNA-expressie in perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) van ME/CVS-patienten en gezonde controles werd geanalyseerd gebruikmakend van de Ambion Bioarray V1. miRNA, aantonend dat de differentiële expressie gevalideerd werd door qRT-PCR en dan gerepliceerd in gefractioneerde bloed leukocyten subgroepen van een onafhankelijke patiëntengroep. Het met ME/CVS in verband gebrachte miRNA dat door deze experimenten werd geïdentificeerd, werd dan getransfecteerd in primaire NK-cellen en genexpressieanalyses werden uitgevoerd om hun doelgenen te identificeren.

Resultaten

Microarray-analyses identificeerden differentiële expressie van 34 miRNA’s, die allemaal geactiveerd waren. Vier van de 34 miRNA’s hadden bevestigde expressieveranderingen door qRT-PCR. Fractioneren van PBMC-monsters per celtype van een onafhankelijke patiëntengroep identificeerde veranderingen in miRNA-expressie in NK-cellen, B-cellen en monocyten, waarbij de meest significante afwijkingen voorkwamen in NK-cellen. Het transfecteren van primaire NK-cellen met hsa-miR-99b of hsa-miR-330-3p, resulteerde in veranderingen in genexpressie die consistent waren met NK-celactivatie, maar met verminderde cytotoxiciteit, suggererend dat defecte NK-celfunctie bijdraagt aan de pathologie van ME/CVS.

Conclusie

Deze studie toont veranderde microRNA-expressie aan in de perifere mononucleaire bloedcellen van ME/CVS-patiënten, die potentiële diagnostische biomarkers zijn. De grootste mate van miRNA-ontregeling werd geïdentificeerd in NK-cellen met doelen die consistent waren met cellulaire activatie en veranderde effectorfunctie.

Publicatie

Petty RD, et al. PLoS One, 2016 Mar 11; 11(3): e0150904

Financiering

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Chronic Fatigue Syndrome Research Foundation (CFSRF), die ook het salaris van RDP financierde, en gedeeltelijk gefinancierd door ME research UK. Het salaris van JRK werd gefinancierd door Joseph Hotung.

Commentaar door ME Research UK

Ribonucleïnezuur (RNA) wordt in alle levende cellen gevonden, en controleert de productie van de proteïnen die nodig zijn voor alle essentiële functies van het leven, van hormonen tot immunologische reacties. Het komt in verschillende vormen voor en de meest bekende is messenger RNA die informatie doorgeeft van ons DNA naar de plaatsen waar proteïnes werkelijk worden gemaakt. In de afgelopen paar jaar is echter een andere fascinerende vorm geïdentificeerd – microRNA of miRNA. Terwijl andere types RNA een “positieve” rol hebben in het vervaardigen van proteïnes, hebben miRNA’s de neiging om te beletten dat er dingen plaatsvinden – zij leggen miRNA-moleculen ‘het zwijgen op’ door hen te splitsen, te destabiliseren of hen te verhinderen hun werk te doen.

Er is veel moeite gedaan om te ontdekken of miRNA’s betrokken zijn bij ziekten bij de mens, en een rol in kanker werd voor het eerst gerapporteerd in 2002 bij chronische lymfatische leukemie (lees meer). Sindsdien is een groot scala van verschillende miRNA-moleculen in verband gebracht met verschillende ziekten en, in feite is er een speciale database die informatie bevat over deze verbanden (lees meer). Terwijl het nu duidelijk is dat miRNA’s betrokken zijn bij het reguleren van de bloedcelvorming en het matigen van cascades in het immuunsysteem, spelen zij waarschijnlijk een rol in het beperken of bedwingen van het werk van vele, zo niet de meeste, biochemische reactiepaden in het lichaam.

Dr. Robert Petty en Dr. Jonathan Kerr (Queen Mary University of London en St. George’s University of London & Universidad del Rosario, Colombia) hebben recent een paper gepubliceerd in het tijdschrift PlosOne (lees meer) over de rol van miRNA’s bij ME/cvs. Het werk werd uitgevoerd gedurende het afstudeerproject van Dr. Petty (PhD), en de onderzoeksgroep ontving in de loop van de jaren onder andere financiering van ME Research UK en de CFS Research Foundation, en produceerden daarbij een scala aan wetenschappelijke rapporten (lees meer).

Het team onderzocht miRNA-expressie bij mononucleaire witte bloedcellen (T-cellen, B-cellen, natural killer (NK)-cellen en monocyten die betrokken zijn bij de afweer en immuniteit) bij patiënten die voldeden aan de Fukuda criteria en Canadese Consensus Criteria en gezonde controles. Er waren drie stadia in het experimentele werk. De eerste stap was om te bepalen of miRNA-expressie (d.w.z. de activiteit daarvan) verschilde tussen 15 ME/cvs-patiënten en 30 gezonde controlepersonen. Vervolgens voerden de onderzoekers een replicatiestadium uit, waarbij ze probeerden om hun bevindingen te repliceren in een andere onafhankelijke groep van 20 ME/cvs-patiënten en 20 controles, en om de specifieke vormen van mononucleaire cellen die betrokken zijn, te identificeren. De laatste stap betrof een apart experiment om de zien of de met ME/cvs geassocieerde miRNA’s in verband gebracht konden worden met afzonderlijke genen door hen te ‘transfecteren’ in primaire NK-cellen en te observeren welke genen geproduceerd werden.

http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0150904

Ongecontroleerde clusteranalyse van miRNA microarray data. Elke kolom vertegenwoordigt een monster, elke rij een miRNA. miRNA-expressie wordt in rood weergegeven voor sterke expressie, groen voor lage expressie en grijs voor data die uitgesloten worden door normalisatie.

In essentie identificeerde de analyse ‘differentiële expressie’ of activatie van 34 miRNA’s, die allemaal geactiveerd waren. Gebruikmakend van kwantitatieve PCR om de bevindingen te valideren, werden veranderingen in de expressie bevestigd bij vier van deze miRNA’s – hsa-miR-99b, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-30c en hsa-miR-126 – die bovendien geschikt werden bevonden voor verder onderzoek als potentiële biomarkers voor ME/cvs omdat hun specificiteit varieerde van 0.71 tot 0.78. De twee miRNA’s die de grootste gradatie van overexpressie lieten zien, waren hsa-miR-99b en hsa-miR-330-3p, waarvan bekend is dat zij belangrijk zijn bij andere ziekten. Hsa-miR-99b bijvoorbeeld heeft een onderscheidend patroon van microRNA-expressie bij primaire spierziekten (lees meer), terwijl hsa-miR-330-handtekeningen in verband worden gebracht met bepaalde lymfomen (lees meer).

Bij de replicatieanalyse werden veranderingen gevonden in miRNA-expressie in de vier types van witte bloedcellen, met de meest significante afwijkingen bij NK-cellen voorkomend. ‘Transfectie’ van NK-cellen met hsa-miR-99b of has-miR-330-3p leidde tot wijzigingen in genexpressie, waaronder genen die betrokken zijn bij de activatie van celluaire processen en immuniteit. De onderzoekers concludeerden dat de NK-cellen ‘geactiveerd’ waren, maar met een verminderde werking, consistent met wat we al weten over de lage activiteit van deze cellen bij ME/cvs (lees meer).

Algeheel genomen ontdekten de onderzoekers dat de expressie van vier miRNA’s in mononucleaire witte bloedcellen het potentieel hebben als biomarker voor ME/CVS, vooral hsa-miR-99b en hsa-miR-330-3p, die ook betrokken zouden kunnen zijn bij de NK-celdisfunctie die kenmerkend is voor de ziekte. Zoals de auteurs duidelijk maken, zijn de resultaten vooral interessant omdat de messenger RNA’s die worden gereguleerd door hsa-miR-99b en hsa-miR-330-3p een grote mate van overlap vertonen met de messenger RNA’s die geactiveerd waren in voorgaand werk door de Kerr-groep, wat de casus versterkt voor de rol van afwijkingen in het aangeboren immuunsysteem bij de pathogenese van ME/cvs.

Omdat miRNA’s ‘beschermd’ en stabiel zijn in verschillende lichaamsvloeistoffen en weefsels, is er nu een enorme hoeveelheid literatuur over hun gebruik als potentiële biomarkers, vooral bij kanker, maar ook in ziekten als epilepsie, malaria en multiple sclerose. In al deze ziekten is er behoefte aan niet-invasieve, makkelijk op te sporen gevoelige biomarkers, en ME/cvs is daar niet anders in. Om die reden verdienen deze interessante bevindingen het, om verder uitgewerkt te worden in grote validatiestudies, evenals in onderzoeken om de specifieke rol op te helderen die het immuunsysteem speelt in de pathogenese van de ziekte.

© ME Research UK. Vertaling Meintje, redactie Zuiderzon, ME-gids.